切向流技術(shù)應(yīng)用之CAR-T：慢病毒載體下游純化工藝
時間：2025.03.31
嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法在腫瘤治療領(lǐng)域取得了突破性進展，而慢病毒載體（Lentiviral Vector, LV）作為基因遞送系統(tǒng)的核心原材料，其下游純化工藝的優(yōu)化直接關(guān)系到治療的安全性和經(jīng)濟性。本文系統(tǒng)綜述了LV下游純化工藝的三大階段——澄清過濾、純化與精純滅菌的技術(shù)進展，重點探討切向流過濾（TFF）的應(yīng)用策略，分析膜材料選擇、工藝參數(shù)控制對LV活性與回收率的影響，并提出規(guī)?；a(chǎn)中面臨的挑戰(zhàn)與未來研究方向。
CAR-T療法與慢病毒載體的重要性
CAR-T療法通過基因工程改造患者T細(xì)胞實現(xiàn)精準(zhǔn)抗腫瘤效應(yīng)，其臨床療效已在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得顯著突破。然而，CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝復(fù)雜，其中慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)成本占比高達(dá)30%-50%，且LV的活性與純度直接影響CAR-T細(xì)胞的功能與安全性。因此，構(gòu)建高效、穩(wěn)定且符合GMP要求的LV下游純化工藝，成為推動CAR-T療法產(chǎn)業(yè)化的核心課題。
慢病毒載體下游純化的三大步驟
慢病毒的活性受到工藝過程中溫度、pH、鹽濃度、滲透壓以及剪切力的影響，因此在下游純化過程中需要格外關(guān)注這些條件對慢病毒載體活性的影響。
1、澄清過濾
澄清過濾旨在去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞碎片及大顆粒雜質(zhì)（>1 μm）。當(dāng)前主流的工藝結(jié)合低速離心（<5000×g）與深層過濾技術(shù)，通過錯流設(shè)計可有效降低濾器堵塞風(fēng)險，尤其適用于中試及以上規(guī)模的連續(xù)處理。例如，采用孔徑為0.45-1.2 μm的聚醚砜（PES）深層濾膜，可高效截留顆粒污染物并減少80%以上的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）負(fù)載量，為后續(xù)純化階段奠定高質(zhì)量基礎(chǔ)。
1、澄清過濾
澄清過濾旨在去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞碎片及大顆粒雜質(zhì)（>1 μm）。當(dāng)前主流的工藝結(jié)合低速離心（<5000×g）與深層過濾技術(shù)，通過錯流設(shè)計可有效降低濾器堵塞風(fēng)險，尤其適用于中試及以上規(guī)模的連續(xù)處理。例如，采用孔徑為0.45-1.2 μm的聚醚砜（PES）深層濾膜，可高效截留顆粒污染物并減少80%以上的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）負(fù)載量，為后續(xù)純化階段奠定高質(zhì)量基礎(chǔ)。
2、純化
適用于LV中度純化的策略主要包括層析和切向流過濾。切向流過濾（TFF）中的超濾滲濾（UFDF）是慢病毒載體（LV）大規(guī)模純化和濃縮以及緩沖液置換的關(guān)鍵步驟。
在UFDF過程中，病毒顆粒被濃縮的同時，分子量小于膜孔徑的雜質(zhì)（如DNA）會隨透過液被有效去除。從工藝流程的角度來看，TFF既可以在澄清后階段應(yīng)用，通過濃縮減少后續(xù)層析步驟的料液體積，也可以在中度純化和精純之間使用，通過緩沖液置換調(diào)節(jié)樣品的pH和電導(dǎo)率，從而為后續(xù)層析操作創(chuàng)造有利條件。
由于LV容易失活，工藝過程中需要嚴(yán)格控制剪切力、通量、跨膜壓和操作時間等參數(shù)，并選擇合適的膜材料和孔徑，以確保LV的活性。適用于LV純化的膜材料包括聚醚砜（PES）和再生纖維素（RC）。此外，膜孔徑的選擇也至關(guān)重要：孔徑越大，雜質(zhì)清除率越高，但可能導(dǎo)致LV回收率下降。因此，需要根據(jù)具體工藝條件選擇最合適的膜材料和孔徑。
3、精純及滅菌
適用于LV精純的策略主要有SEC（尺寸排阻色譜）以及TFF（切向流過濾）。通過TFF進一步濃縮，供需要更高濃度病毒的群體使用。不過高剪切力（>5000 s?¹）與跨膜壓（TMP>1.5 bar）易導(dǎo)致LV衣殼破裂，需通過動態(tài)壓力控制將通量維持在20-40 LMH以維持活性。最后進行無菌過濾，通常選用0.22μm的濾膜進行過濾進行灌裝。
適用于LV中度純化的策略主要包括層析和切向流過濾。切向流過濾（TFF）中的超濾滲濾（UFDF）是慢病毒載體（LV）大規(guī)模純化和濃縮以及緩沖液置換的關(guān)鍵步驟。
在UFDF過程中，病毒顆粒被濃縮的同時，分子量小于膜孔徑的雜質(zhì)（如DNA）會隨透過液被有效去除。從工藝流程的角度來看，TFF既可以在澄清后階段應(yīng)用，通過濃縮減少后續(xù)層析步驟的料液體積，也可以在中度純化和精純之間使用，通過緩沖液置換調(diào)節(jié)樣品的pH和電導(dǎo)率，從而為后續(xù)層析操作創(chuàng)造有利條件。
由于LV容易失活，工藝過程中需要嚴(yán)格控制剪切力、通量、跨膜壓和操作時間等參數(shù)，并選擇合適的膜材料和孔徑，以確保LV的活性。適用于LV純化的膜材料包括聚醚砜（PES）和再生纖維素（RC）。此外，膜孔徑的選擇也至關(guān)重要：孔徑越大，雜質(zhì)清除率越高，但可能導(dǎo)致LV回收率下降。因此，需要根據(jù)具體工藝條件選擇最合適的膜材料和孔徑。
3、精純及滅菌
適用于LV精純的策略主要有SEC（尺寸排阻色譜）以及TFF（切向流過濾）。通過TFF進一步濃縮，供需要更高濃度病毒的群體使用。不過高剪切力（>5000 s?¹）與跨膜壓（TMP>1.5 bar）易導(dǎo)致LV衣殼破裂，需通過動態(tài)壓力控制將通量維持在20-40 LMH以維持活性。最后進行無菌過濾，通常選用0.22μm的濾膜進行過濾進行灌裝。
▲Oxford BioMedica為諾華Kymriah代工的慢病毒制造流程（圖片來源：Molecular Therapy）
當(dāng)前挑戰(zhàn)和未來方向
盡管LV純化技術(shù)已取得顯著進展，仍存在以下瓶頸：
（1）膜污染導(dǎo)致的批次間一致性差異；
（2）超離心與層析設(shè)備的高資本投入；
（3）LV體外穩(wěn)定性不足導(dǎo)致的冷鏈運輸成本攀升。
為進一步提升LV生產(chǎn)的可及性與經(jīng)濟性，未來研究可聚焦于：
（1） 新型仿生膜材料（如石墨烯氧化物復(fù)合膜）的開發(fā)
（2） 連續(xù)流純化工藝的整合
（3）凍干制劑技術(shù)的突破
慢病毒載體（LV）下游純化是CAR-T療法產(chǎn)業(yè)化的核心環(huán)節(jié)，而切向流過濾（TFF）的應(yīng)用顯著提升了LV的純度和回收率。然而，膜污染、工藝穩(wěn)定性及冷鏈依賴仍是主要挑戰(zhàn)。未來，通過新材料開發(fā)、連續(xù)流工藝優(yōu)化和凍干技術(shù)創(chuàng)新，有望進一步突破技術(shù)瓶頸，推動CAR-T療法從實驗室走向更廣泛的臨床應(yīng)用。
（1）膜污染導(dǎo)致的批次間一致性差異；
（2）超離心與層析設(shè)備的高資本投入；
（3）LV體外穩(wěn)定性不足導(dǎo)致的冷鏈運輸成本攀升。
為進一步提升LV生產(chǎn)的可及性與經(jīng)濟性，未來研究可聚焦于：
（1） 新型仿生膜材料（如石墨烯氧化物復(fù)合膜）的開發(fā)
（2） 連續(xù)流純化工藝的整合
（3）凍干制劑技術(shù)的突破
慢病毒載體（LV）下游純化是CAR-T療法產(chǎn)業(yè)化的核心環(huán)節(jié)，而切向流過濾（TFF）的應(yīng)用顯著提升了LV的純度和回收率。然而，膜污染、工藝穩(wěn)定性及冷鏈依賴仍是主要挑戰(zhàn)。未來，通過新材料開發(fā)、連續(xù)流工藝優(yōu)化和凍干技術(shù)創(chuàng)新，有望進一步突破技術(shù)瓶頸，推動CAR-T療法從實驗室走向更廣泛的臨床應(yīng)用。
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HOLVES提供不同類型的發(fā)酵罐知識、技術(shù)文章，例如：發(fā)酵罐發(fā)展歷史、發(fā)酵罐日常保養(yǎng)。在發(fā)酵罐產(chǎn)品更新方面，最新的新生代實驗室玻璃發(fā)酵罐，能滿足更多用戶的需求。
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